Según el Laboratorio Copisa, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus(LAL) dispone de tres métodos analíticos para determinar las endotoxinas bacterianas. Estos métodos son:
Método Gel-Clot
La cantidad de gel producida por la reacción que se produce en el lisado de amebocitos cuando hay endotoxinas se mide mediante el método Gel-Clot o de gelificación. Las endotoxinas provocan una serie de reacciones en cadena que coagulan la proteína coagulina en la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus. Esta respuesta es claramente visible por la aparición del gel en el tubo de ensayo. Para determinar si la prueba de LAL ha dado un resultado positivo mediante el método del coágulo de gel, debe invertirse el tubo de reacción y comprobar que el gel producido tras este procedimiento sigue distinguiéndose de la mezcla.
Esta aplicación cualitativa del método del coágulo de gel es ideal para pruebas rápidas en las que es importante determinar si una muestra ha sido contaminada o no por bacterias Gram negativas. La cantidad de endotoxinas presentes en la muestra se determina con la cantidad de gel que se forma en el tubo de reacción.
Método Turbidimétrico
Estas endotoxinas reaccionan con la hemolinfa que contiene el cangrejo, y al reaccionar se ven como proteínas sólidas, lo que altera la muestra. Por ello, al aplicar este método se puede detectar la presencia de endotoxinas.
Las mediciones pueden realizarse por el método cinético o de punto final. El método cinético es el que se utiliza con más frecuencia en la industria para el control de calidad de los productos y la materia prima.
Método Cromogénico
El método cromogénico utilizado en el LAL consiste en añadir un agente revelador del color que permite cuantificar las endotoxinas observando la absorbancia de la muestra. La P-nitroanilina se encuentra inicialmente en un estado incoloro, ya que está unida a un péptido, y se libera en proporción a la cantidad de endotoxinas en la combinación. Este método se emplea con el objetivo de calcular la concentración de endotoxinas a través de la construcción de una curva de calibración.
Cualquier molécula que absorba en longitudes de onda próximas al máximo de absorción de la p-nitroanilina puede alterar los resultados del análisis, como ocurre con cualquier método cromogénico, por lo que la muestra examinada debe estar libre de interferencias en la zona de medición.
